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梯度膠電泳——蛋白條帶為何越跑越銳利

點(diǎn)擊次數(shù)： 更新時(shí)間：2024-04-30

還有兩個(gè)月就要迎來(lái)畢業(yè)季，各位準(zhǔn)碩士、準(zhǔn)博士們想必已經(jīng)做完了實(shí)驗(yàn)，正在整理數(shù)據(jù)，全力準(zhǔn)備答辯，在這里預(yù)祝各位準(zhǔn)畢業(yè)生們畢業(yè)順利。

做了多年WB實(shí)驗(yàn)的同學(xué)們想必非常熟悉SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）了。在傳統(tǒng)的SDS-PAGE中，我們按傳統(tǒng)方式配制分層凝膠，先向膠板中灌入分層膠，待分層膠凝固之后再向其中加入濃縮膠，插上用于分隔上樣孔的梳子之后等待濃縮膠凝固之后便可以使用。凝固的聚丙烯酰胺形成了一張三維立體的網(wǎng)，網(wǎng)眼的疏密與凝膠的密度相關(guān)，濃度越高，網(wǎng)眼越密集，蛋白電泳的速度越慢。蛋白先從濃縮膠中經(jīng)過(guò)，濃縮膠中的pH值較低，各種不同大小的蛋白以相近的速度泳動(dòng)，并不斷堆疊壓縮，待條帶寬度被壓縮到合適的程度，再進(jìn)入分離膠中，分離膠的pH值較高，SDS-蛋白復(fù)合物根據(jù)分子量的大小帶上均勻的負(fù)電荷，每單位分子量所受的電場(chǎng)力是相當(dāng)?shù)模虼嗽陔娪局幸苑肿恿看笮榛鶞?zhǔn)分離成各個(gè)條帶，并基本保持了濃縮膠壓縮之后的形狀。

分層膠電泳原理示意

當(dāng)我們使用分層膠進(jìn)行電泳時(shí)，電壓通常不能過(guò)大，電泳的總產(chǎn)熱量正比于電壓的平方，而過(guò)熱會(huì)導(dǎo)致條帶的寬度變寬，與背景的對(duì)比度降低，進(jìn)而降低條帶的分辨率。所以分層膠電泳通常是比較緩慢的，一般需要90分鐘或以上的時(shí)間。并且需要根據(jù)不同大小的蛋白使用各種不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠。

那么我們有辦法在提高電壓加快電泳速度的同時(shí)還能夠使條帶壓縮得更好，分辨率更高嗎？使用梯度膠不失為一種好辦法。

垂直電泳中梯度膠是指從上到下聚丙烯酰胺濃度不斷增大的凝膠，常用的梯度膠濃度范圍為4~12%、4~15%、4~18%及4~20%。梯度膠可以將不同大小的蛋白均勻地分離開(kāi)，4~20%的梯度膠可以覆蓋絕大多數(shù)常見(jiàn)的蛋白電泳分離需求，將不同大小的蛋白在不同濃度的區(qū)域進(jìn)行分離。除了有利于廣分子量范圍的蛋白條帶分離，梯度膠還有一個(gè)重要的性質(zhì)——蛋白條帶的自壓縮。

不知道各位讀者有沒(méi)有見(jiàn)過(guò)海浪，仔細(xì)觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)海浪的形狀幾乎總是和海岸基線的形狀相同的，近岸的海浪總是平行于海岸的。

海岸邊一波波涌來(lái)的海浪

這是由于海浪作為有限振幅波，其運(yùn)動(dòng)速度與海水的深度相關(guān)，因?yàn)楹Ｋ綔\，波的振動(dòng)與傳播受到海底泥沙砂石等固體的影響，就會(huì)越慢。當(dāng)海浪靠近海岸時(shí)，前排的海浪會(huì)受到越來(lái)越淺的海水的影響，移動(dòng)速度逐漸降低，后續(xù)的海浪則會(huì)縮短與前排海浪的距離，直到它們的波前重疊在一起，此時(shí)海浪的波前線的形狀就與海水的等深線重合，也與海岸基線重合（因?yàn)橥ǔｋx海岸基線越遠(yuǎn)的海水越深）。

海浪由于越來(lái)越大的運(yùn)行阻力而不斷重疊，與海岸基線保持平行的現(xiàn)象，和梯度膠中蛋白自壓縮的現(xiàn)象頗為相似。梯度膠中蛋白從上到下電泳，不斷從阻力較小的低濃度區(qū)域泳動(dòng)至阻力較大的高濃度區(qū)域，并不斷被減速，此時(shí)相同大小的蛋白所形成的較寬的條帶中，靠后的蛋白處于濃度較低的區(qū)域中，泳動(dòng)速度較快，而靠前的蛋白則位于濃度較高的區(qū)域中，泳動(dòng)速度較慢，隨著電泳的持續(xù)進(jìn)行，靠后的蛋白就會(huì)縮短與靠前的蛋白的距離，直到與其重疊，此時(shí)條帶的形狀與梯度膠的等濃度線重合，條帶也被壓縮到非常窄的區(qū)域內(nèi)。

這便是梯度膠電泳中的蛋白條帶自壓縮現(xiàn)象。由于自壓縮所帶來(lái)的全程壓縮，梯度膠可以不用灌制濃縮膠（當(dāng)然也可以結(jié)合濃縮膠和梯度膠來(lái)進(jìn)一步提高壓縮效果），并全程使用200V或以上的高電壓進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間也可以縮短到50min左右，與此同時(shí)也能夠保持較好的條帶寬度、對(duì)比度，電泳條帶銳利清晰，提高蛋白條帶的分辨率。

在實(shí)驗(yàn)室中手動(dòng)灌制梯度膠是比較困難的，所以各位讀者可以選用中科通儀自動(dòng)梯度制膠儀進(jìn)行制作，一鍵灌裝，省心省力，助力您的科研事業(yè)。

中科通儀自動(dòng)梯度制膠儀

4~18%梯度膠電泳效果示意圖

上文中通過(guò)海浪給各位讀者一個(gè)形象描述梯度膠自壓縮特性的方式，其實(shí)類(lèi)似的現(xiàn)象在很多情況中都有發(fā)生，有時(shí)未必是好事，譬如在戰(zhàn)斗機(jī)以亞音速飛行的過(guò)程中，戰(zhàn)斗機(jī)機(jī)頭推動(dòng)空氣在機(jī)身前方形成了一個(gè)空氣的高壓區(qū)，機(jī)身高速運(yùn)動(dòng)所發(fā)出的各種噪聲以密度波的形式以聲速向前方傳播，而高壓區(qū)中的當(dāng)?shù)芈曀俑哂跈C(jī)頭高壓區(qū)更前方還未被擾動(dòng)的空氣中的聲速，此時(shí)不斷因?yàn)樗俣雀於飞蠙C(jī)頭高壓區(qū)的聲波便堆積形成了一堵以聲速運(yùn)動(dòng)、高溫高壓的空氣墻，也就是所謂的音障，這極大地阻礙了戰(zhàn)斗機(jī)的進(jìn)一步提速，同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)身的材料及結(jié)構(gòu)剛性提出更高要求。

即將突破音障的超音速戰(zhàn)機(jī)

從亞音速飛行的戰(zhàn)斗機(jī)前方的音障，到平行于海岸傳播的海浪，再到梯度膠中自壓縮的蛋白條帶，物理學(xué)的原理無(wú)分大小，規(guī)制著整個(gè)物質(zhì)世界的運(yùn)行。

感謝各位讀者的閱讀，再次預(yù)祝各位準(zhǔn)畢業(yè)生們順利畢業(yè)，前方一路坦途。

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